Cell | 颠覆性进展！刘如谦团队进行了遗传改造，将先导编辑的效率提高近8倍，推动先导编辑技术走向临床！

虽然先导编辑（prime editing）能够在 DNA 中实现精确的序列编辑，但先导编辑的细胞决定因素仍然知之甚少。2021年10月14日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）及普林斯顿大学Britt Adamson共同通讯在Cell 在线发表题为“Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes”的研究论文，该研究使用CRISPRi 筛选，发现 DNA 错配修复 (MMR) 阻碍了先导编辑并促进了不需要的 indel 副产物。该研究开发了 PE4 和 PE5 先导编辑系统，其中与 PE2 和 PE3 系统相比，工程化 MMR 抑制蛋白的瞬时表达将替换、小插入和小缺失先导编辑的效率分别平均提高了 7.7 倍和 2.0 倍，同时在 MMR 细胞类型中将编辑/插入删除比率提高了 3.4 倍。在先导编辑附近安装沉默突变可以通过规避 MMR 来增强先导编辑结果。 先导编辑器蛋白质优化导致 PEmax 架构在 HeLa 细胞中将编辑效率平均提高 2.8 倍。总之，这些发现丰富了对先导编辑的理解，并建立了先导编辑系统，该系统在 7 种哺乳动物细胞类型的 191 次编辑中显示出实质性改进。

另外，2021年10月4日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency”的研究论文，该研究展示了包含逆转录酶模板和引物结合位点的 pegRNA 3' 区域的降解会毒害先导编辑系统的活性，从而阻碍编辑效率。该研究将结构化的 RNA 基序合并到 pegRNA 的 3' 末端，以增强其稳定性并防止 3' 延伸的降解。由此产生的工程化 pegRNAs (epegRNAs) 在 HeLa、U2OS 和 K562 细胞以及原代人成纤维细胞中将主要编辑效率提高了 3-4 倍，而不会增加脱靶编辑活动。该研究优化了 3' 结构基序的选择并开发了 pegLIT，这是一种用于识别 pegRNA 和 3' 基序之间的非干扰核苷酸接头的计算工具。最后，该研究表明 epegRNA 提高了安装或纠正与疾病相关的突变的效率（点击阅读）。

2021年6月28日，博德研究所刘如谦，加州大学旧金山分校Britt Adamson及Jonathan S. Weissman在Nature Biotechnology 在线发表题为“Efficient C•G-to-G•C base editors developed using CRISPRi screens, target-library analysis, and machine learning”的研究论文，该研究描述了一套与机器学习模型配对的工程 CGBE，以实现高效、高纯度的 C•G 到 G•C 碱基编辑。该研究进行了针对 DNA 修复基因的 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选，以确定影响 C•G 到 G•C 编辑结果的因素，并利用这些见解开发具有不同编辑配置特征的 CGBE。总之，这项工作中提出的碱基编辑器和计算工具大大提高了 CGBE 介导的颠换碱基编辑的靶向范围、有效性和实用性（点击阅读）。

2021年6月2日，博德研究所David R. Liu（刘如谦）等团队在Nature 在线发表题为“Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice”的研究论文，该研究使用定制的腺嘌呤碱基编辑器 (ABE8e-NRCH) 将 SCD 等位基因 (HBBS) 转换为Makassar β-珠蛋白 (HBBG)，这是一种非致病性变异 。将编码碱基编辑器和靶向指导 RNA 的 mRNA 离体递送到 SCD 患者的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中，导致 80% 的 HBBS 转化为 HBBG。将编辑过的人类 HSPC 移植到免疫缺陷小鼠中 16 周后，HBBG 的频率为 68%，缺氧诱导的骨髓网织红细胞镰状细胞减少了 5 倍，表明基因编辑是持久的。为了评估 HBBS 碱基编辑的生理效应，该研究提供了 ABE8e-NRCH 并将 RNA 从人源化 SCD 小鼠导入 HSPC，然后将这些细胞移植到辐射小鼠中。十六周后，Makassar β-珠蛋白占血液中 79% 的 β-珠蛋白，缺氧引起的镰状细胞减少了三倍。与接受未编辑细胞的小鼠相比，接受碱基编辑的 HSPC 的小鼠显示出接近正常的血液学参数和减少的脾脏病理。编辑过的骨髓的二次移植证实了基因编辑在长期造血干细胞中是持久的，并表明 20% 或更多的 HBBS-to-HBBG 编辑足以进行表型拯救。人类 HSPC 的碱基编辑避免了在 Cas9 核酸酶处理后观察到的 p53 激活和更大的缺失。总之，这些发现表明 SCD 的一次性自体治疗可以消除致病性 HBBS，产生良性 HBBG，并最大限度地减少双链 DNA 断裂的不良后果（点击阅读）。

2021年2月19日，博德研究所刘如谦(David R.Liu)及哈佛医学院Dong Min共同通讯在Science 在线发表题为”Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity“的研究论文，该研究开发了具有同时阳性和阴性选择的噬菌体辅助蛋白酶进化系统，并将其应用于三种肉毒杆菌神经毒素（BoNT）轻链蛋白酶。该研究将BoNT / X蛋白酶进化为单独的变异体，这些变异体优先裂解囊泡相关膜蛋白4（VAMP4）和Ykt6，进化了BoNT / F蛋白酶以选择性裂解非天然底物VAMP7，并进化了BoNT / E蛋白酶以裂解磷酸酶和肌腱同源蛋白（PTEN），但不是神经元中的任何天然BoNT蛋白酶底物。进化的蛋白酶显示出特异性的大变化（218倍到 11,000,000倍），并且可以保留其形成自我递送至初级神经元的全毒素的能力。这些发现为重新编程蛋白酶建立了通用平台，以选择性地切割具有治疗意义的新靶标（点击阅读）。

以可编程方式操纵基因组的能力照亮了生物学，并在遗传疾病的临床治疗中显示出前景。为了实现广泛的序列变化，研究人员开发了先导编辑（prime editing），这是一种通用的基因编辑方法，可以安装所有类型的靶向 DNA 碱基对替换、小插入、小删除及其组合，而无需双链 DNA 断裂（DSB）或供体 DNA 模。

先导编辑已广泛应用于在果蝇、水稻和小麦、斑马鱼、小鼠胚胎、出生后小鼠、人类干细胞和患者来源的类器官中引入遗传变化。尽管具有多功能性，但先导编辑的效率可能因编辑类别、目标基因座和细胞类型而异。为了最大限度地发挥先导编辑的效用，研究人员试图确定先导编辑结果的细胞决定因素，并使用由此产生的见解来开发改进的先导编辑系统。

先导编辑至少需要两个组件：与 Cas9 切口酶（PE2 蛋白）融合的工程逆转录酶 (RT) 和先导编辑向导 RNA (pegRNA)。PE2-pegRNA 复合物结合目标 DNA 基因座的一条链并切开另一条链，暴露出 DNA 3' 端，可与 pegRNA 延伸中的引物结合位点 (PBS) 杂交。在 pegRNA 延伸中逆转录 RT 模板然后生成一个 3' DNA 瓣，其中包含编辑的序列并最终导致该序列整合到基因组中。“PE3”系统与 PE2 不同，它使用额外的单向导 RNA (sgRNA) 在远离 pegRNA 靶标的位置切割未编辑的链，从而提高编辑效率。然而，在非编辑链上切割也会增加目标位点不希望的插入和缺失（indels）的频率。

体外实验为先导编辑的早期步骤提供了支持，但 3' 瓣合成下游的机制仍然是推测性的。根据目前的模型，新合成的 3' 瓣通过瓣互变取代了相邻的基因组 DNA 链。切除移位的 5' 瓣，然后将编辑过的序列连接到基因组中。在 PE3 系统中切割非编辑链被认为会诱导非编辑链的细胞置换，从而促进编辑序列在两条链中的安装。

文章模式图（图源自Cell ）

细胞因子在这些步骤中的假定参与促使该研究探索DNA 修复机制在先导编辑中的作用，并通过操纵这些过程来开发改进先导编辑系统。在这里，该研究使用基于合并 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 系统地探测参与 DNA 修复和相关过程的 476 个基因对先导编辑结果的影响。

该研究发现特定的 DNA 错配修复 (MMR) 基因会强烈抑制先导编辑效率并促进插入缺失的形成。与 MMR 恢复在先导编辑期间形成的异源双链 DNA 的模型一致，该研究确定了不易受 MMR 活动影响并因此更有效地生成的先导编辑类别。整合这些发现，该研究通过显性阴性 MMR 蛋白 (MLH1dn) 的瞬时表达开发了改进的先导编辑系统。

在包括诱导多能干细胞 (iPSC) 和原代 T 细胞在内的六种 MMR 细胞类型中，这些 PE4 (PE2+MLH1dn) 和 PE5 (PE3+MLH1dn) 系统将编辑效率比 PE2 和 PE3 提高了 7.7 倍和 2.0 倍，编辑/插入/插入比率（结果纯度）增加了 3.4 倍。MLH1dn 的瞬时共表达不会导致检测到的微卫星重复长度变化。最后，该研究设计了一个优化的“PEmax”先导编辑器架构，进一步提高了与 PE4、PE5 和工程化 pegRNAs (epegRNAs) 协同工作的编辑效率。总之，这些发现加深了对先导编辑的理解，并建立了先导编辑系统，在七种哺乳动物细胞类型的 20 个基因座的 191 种不同编辑中显著提高了效率和结果纯度。

参考消息：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(21)01065-5

来源：iNature

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